پایان نامه با کلید واژه های بیوتکنولوژی

دانلود پایان نامه

زنجیرهای پلیمراز
مواد مورد نیاز غلظت نهایی مقدار

نمونه DNA 200-150 نانوگرم 1 میکرولیتر
بافر X1 5/2 میکرولیتر
Mgcl2 1 میلی‏مولار 1 میکرولیتر
dNTP 2/0 میلی‏مولار 5/0 میکرولیتر
پرایمر (رفت) 10 پیکومول 1 میکرولیتر
پرایمر (برگشت) 10 پیکومول 1 میکرولیتر
آنزیم تک پلیمراز unit 1 2/0 میکرولیتر
آب استریل متغیر .8/17 میکرولیتر
حجم کل 25 میکرولیتر

3-7-2 پارامترهای واکنش زنجیرهای پلیمراز
جهت بهینه کردن واکنشهای PCR الگوهای حرارتی به روش شیب حرارتی و در نهایت الگوهای حرارتی زیر (جدول 2-3) با 35 چرخه ایدهآلترین شرایط برای تکثیر ناحیه مورد نظر، انتخاب گردید.

جدول 3-2 پارامترهای حرارتی واکنش زنجیرهای پلیمراز
مرحله
واسرشت
اتصال
تکثیر
تعداد سیکل
اول
95 درجه سانتیگراد 5 دقیقه


1
دوم
95 درجه سانتیگراد 30 ثانیه
4/58درجه سانتیگراد 30 ثانیه
72 درجه سانتیگراد 30ثانیه
35
سوم

72 درجه سانتیگراد 10 دقیقه
1

3-7-3 تجهیزات مورد نیاز
ترموسایکلر
میکروسانتریفبوژ
ورتکس
نوک سمپلر و میکروتیوپ
3-7-4 مراحل انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز
ابتدا مخلوط اصلی را آماده کرده و تمام مواد به غیر از آنزیم تک پلیمراز اضافه شد.
میکروتیوپها را به صورت کنترل منفی و نمونههای مورد استفاده را علامتگذاری گردید.
از ژنوم مرغ حدود 200 نانوگرم (1 الی 2 مایکرو) و برای نمونه کنترل منفی آب مقطر وارد میکروتیوپ میکنیم.
به مخلوط نهایی آنزیم تک پلیمراز را اضافه کرده و ورتکس گردید.
به میکروتیوپهای حاوی ژنوم 22 میکرولیتر از مخلوط نهایی اضافه کرده و نمونهها سانتریفیوژ گردید.
6- نمونهها را در دستگاه ترموسایکلر قرار داده و برنامه PCR شروع گردید.
3-7-5 بررسی محصولات PCR
روش معمول بررسی کیفیت محصولات PCR، وجود یا عدم وجود و یا مقدار تولید محصول با استفاده از الکتروفورز محصول PCR بر ژل آگارز است. برای این منظور با قرار دادن پنج میکرولیتر از نمونه محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد و رنگآمیزی با Safe stain، دی.اِن.اِ تولید شده برای قطعه مورد نظر تکثیر شد به صورت یک باند مجزا قابل رؤیت گردید.

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد درموردامر به معروف و نهی از منکر

3-8 هضم آنزیمی
3-8-1 برش آنزیمی محصولات PCR
در روش PCR-RFLP پس از انجام عمل PCR و تکثیر ناحیهای از ژن مورد نظر بایستی قطعه تکثیر یافته را در معرض آنزیم مناسب قرار داده شود تا تشخیص آللها امکان پذیر گردد.
3-8-1-1 روش اجرای کار
دستورالعملی که برای هضم آنزیمی قطعه تکثیر یافته به کار رفت در جدول 3-3 و 3-4 آورده شده است.

جدول 3-3 مواد مورد نیاز هضم آنزیمی CfrI
مواد مقدار
محصولPCR 10 میکرولیتر
بافر رقیق کننده 1 میکرولیتر
آنزیم CfrI 5/0.میکرولیتر
H2O 5/18میکرولیتر
حجم کل 30 میکرولیتر

جدول 3-4 مواد مورد نیاز هضم آنزیمی BseNI
مواد مقدار
محصولPCR 10 میکرولیتر
بافر رقیق کننده 2 میکرولیتر
آنزیم BseNI 1میکرولیتر
H2O 17میکرولیتر
حجم کل 30 میکرولیتر

بعد از افزودن مخلوط نهایی به میکروتیوتیپها و سانتریفوژ کردن نمونهها را به مدت 16 ساعت در دمای 65 درجه برای آنزیم BseNI، و به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه برای آنزیم CfrI، در داخل بنماری گذاشته شد. سپس مقدار 10 میکرولیتر از محصول هضم روی ژل آگارز 3 درصد بارگذاری شد و برای تشخیص اندازه باندها سایز مارکر 100 به کار برده شد. نمونهها به مدت 80 دقیقه در 90 ولت الکتروفورز گردید. سپس با استفاده از دستگاه ژلداک از ژل عکس برداری گردید.
3-9 تجزیه آماری ژنوتیپها
پس از اتمام کارهای آزمایشگاهی و تعیین ژنوتیپ تمام نمونهها، کلیه دادهها وارد Excel شده سپس با نرمافزار GenAlex آنالیز گردید سپس فراوانی آللی، ژنوتیپی، وجود تعادل هاردی- وینبرگ مورد بررسی قرار گرفت.
.

فصل چهارم
نتایج و بحث

فصل چهار
نتایج و بحث
4-1 استخراج دی. اِن. اِ
موفقیت در اجرای تکنیکهای مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی منوط بر داشتن منبع دی. اِن. اِ مطلوب و عاری از هر گونه ناخالصی اس
ت. دی. اِن. اِ استخراج شده پس از استفاده از RNAas و تعیین کمیت و کیفیت به وسیله نانودراپ (شکل 4-2) بر روی ژل آگارز برده شد و نتایج نشان داد دی. اِن. اِ فاقد هرگونه آلودگی پروتئینی، آلودگی به RNA و شکستگی میباشد. همچنین بررسی غلظت دی. اِن. اِ با استفاده از نانودراپ نشان داد که دی. اِن. اِ استخراج شده در حدود 100-300 نانوگرم بر میکرولیتر میباشد و استخراج دی. اِن. اِ به این روش غلظت مناسبی از دی. اِن. اِ را جهت واکنش زنجیرهای پلیمراز فراهم نموده است. شکل 4-1 کیفیت ژنوم برخی از نمونههای مورد مطالعه را بر روی ژل آگارز به تصویر کشیده است.

مطلب مشابه :  متن کامل پایان نامهحمایت خانواده

شکل 4-1 کیفیت دی. اِن. اِ استخراج شده بر روی ژل آگارز

دیدگاهتان را بنویسید