اثر تنش شوری بر خصوصیات رشدی برخی از ژنوتیپ های انتخابی بادام (Prunus …

۲-۷-۴-۲-سنجش سایر آلدئیدها (پروپانال، بوتانال، هگزانال، هپتانال و پروپانال دی متیل استال)
۲/۰ گرم از بافت تازه برگی از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای ۴ و ۵) در پایان آزمایش در هاون چینی حاوی ۵ میلیلیتر تریکلرواستیک اسید ۱/۰ درصد سائیده شد. عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد. به یک میلیلیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفوژ، ۵ میلیلیتر محلول تریکلرواستیک اسید ۲۰ درصد که حاوی ۵/۰ درصد اسید تیوباربیتوریک بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت ۳۰ دقیقه در دمای Cº۹۵ حمام آب گرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام یخ سرد گردید و مجددأ به مدت ۱۰ دقیقه در ۱۰۰۰۰دور در دقیقه سانتریفوژ شد. میزان جذب نمونهها در طول موج ۴۵۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدندجذب سایر رنگیزههای غیراختصاصی در ۶۰۰ نانومتر خوانده و از این مقدار کسر گردید. برای محاسبه غلظت سایر آلدئیدها از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1105×۴۵۷/۰ استفاده شد. این ضریب خاموشی میانگین ضریب خاموشی برای آلدئیدهای مورد نظر است [Meirs et al, 1992].
۲-۷-۵-پراکسید هیدروژن
۵/۰ گرم از بافت تازه برگ از برگهای شاخه اصلی (برگهای توسعه یافته از گرههای ۴ و ۵) در پایان آزمایش در هاون چینی حاوی تریکلرواستیک اسید ۱/۰ درصد سرد سائیده شد. عصاره حاصل به مدت ۱۵ دقیقه با استفاده از دستگاه سانتریفوژ یخچالدار به مدت ۵ دقیقه در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس به ۵۰۰ میکرو لیتر از محلول رویی، ۵۰۰ میکرو لیتر بافر فسفات پتاسیم ۱۰۰ میلیمولار (۷=pH) و ۲ میلیلیتر یدید پتاسیم ۱ مولار اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت ۱ ساعت در تاریکی در دمای اتاق قرار داده شد. میزان جذب نمونهها در طول موج ۳۹۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Canada BT600 Plus,)، اندازهگیری شدندغلظت پراکسید هیدروژن با استفاده از ضریب خاموشی معادل۱ M-1cm28/0 محاسبه و بر حسب میکروگرم در گرم وزن تر گیاهی محاسبه شد [Veilkova et al., 2000].
۲-۷-۶-پروتئین محلول کل و سنجش فعالیت آنزیمها
۲-۷-۶-۱-تهیه بافر استخراج
تهیه بافر فسفات ۵۰ میلی مولار با pH برابر ۷ به‌صورت زیر می‌باشد:
۱- ۶۸/۰گرم نمک پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) به همراه ۲ گرم PVPP و Na-EDTA در ۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۲- ۸۷/۰گرم نمک پتاسیم مونوهیدروژن فسفات (K2HPO4) به همراه ۲ گرم PVPP و Na-EDTA در ۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل شدند و حجم آن به۱۰۰ میلی‌لیتر رسانده شد.
۳- محلولهای ۱ و۲ به عنوان محلولهای ذخیره بودند که در هر بار آزمایش ۳۹ میلی‌لیتر از محلول ۱ با ۶۱ میلی‌لیتر از محلول ۲ مخلوط شده و pH آن با استفاده از pH‌ متر بین۲/۷-۸/۶ تنظیم میشد.
۲-۷-۶-۲-مرحله استخراج
بهمنظور استخراج و اندازه‌گیری پروتئین محلول کل و آنزیم‌ها، برگ‌های فریز شده در هاون چینی ریخته و نیتروژن مایع به آن اضافه شد. سپس برگ‌ها بهخوبی کوبیده شده تا کاملاً خرد شوند. ۵/۰ گرم از پودر برگ آسیاب‌شده به میکروتیوب‌های ۲ میلی‌لیتری منتقل شدند و یک میلیلیتر از بافر استخراج به آن اضافه و به مدت ۳۰ ثانیه ورتکس شدند. سپس به مدت ۱۵ دقیقه با ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ عصارههای رویی با استفاده از سمپلر برداشته شدند و به میکروتیوب‌های ۵/۱ میلی‌لیتری منتقل شدند و دوباره به مدت ۱۰ دقیقه با ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ، عصارههای رویی با استفاده از سمپلر برداشته و به میکروتیوب‌هایی با همان حجم منتقل شدند. میکروتیوب‌های حاوی عصارهها در زمان سایش برگ‌ها و سانتریفوژ نمونه‌های دیگر در داخل ظرف یخ نگهداری شدند و در صورت عدم استفاده به فریزر۸۰- درجه سانتی‌گراد انتقال داده شدند [Beauchamp and Fridovich, 1971]. از این عصارهها برای سنجش محتوای پروتئین محلول کل و آنزیمهای پراکسیداز، آسکورباتپراکسیداز وکاتالاز استفاده شد.
۲-۷-۶-۳-پروتئین محلول کل
۲-۷-۶-۳-۱-تهیه بافرهای سنجش
۱) معرف بردفورد: ۱۰۰ میلیگرم کوماس بلوجی ۲۵۰ را با ۵۰ میلی لیتر اتانول خالص مخلوط و به حجم ۸۰۰ میلیلیتر رسانده شد. سپس محلول به دست آمده از صافی عبور داده شد و حجم محلول صاف شده با ۱۰۰ میلیلیتر اسید فسفریک خالص و آب مقطر به ۱۰۰۰ میلیلیتر رسانده شد.
۲) محلول استاندارد: ۵ میلیگرم آلبومین گاوی در ۱ میلیلیتر بافر استخراج حل شد. سپس محلول حاصل به هم زده شد و در آب یخ قرار داده شد. سپس به ترتیب طبق جدول زیر، مقادیر فوق از محلول استاندارد و معرف بردفورد برداشته شد و با یکدیگر مخلوط شدند.
جدول ۲-۶-مقادیر برداشته شده از محلول استاندارد و بردفورد به منظور تهیه جدول استاندارد بر حسب میکروگرم در میلیلیتر

۶۰۰ ۴۵۰ ۳۰۰ ۱۵۰ ۶۰ ۳۰ ۱۲ محلول BSA (µl/3Ml)
۱۰۰۰ ۷۵۰ ۵۰۰ ۲۵۰ ۱۰۰ ۵۰ ۲۰ برابر با BSA (µg/Ml)
برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  fumi.ir  مراجعه نمایید.