پایان نامه با کلید واژه های قابلیت اعتماد، عوامل محیطی، فیزیولوژی

میشود که میتوانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتریکها، جابجاییها و الگوهای نواربندی (G, C, R, Q و غیره) از جمله این نشانگرها میباشند.

2-13-4 نشانگرهای مولکولی
نشانگرهای RFLP اولین نشانگرهای توسعه یافته و مطمئنترین روش برای تشخیص پلیمورفیسم میباشند. خاصیت اختصاصی بودن لوکوس، دستهبندی دقیق ژنوتیپها را امکانپذیر میکند. این ویژگی باعث کاربرد گسترده آنها در مطالعات نقشهیابی مقایسهای بین گونههای خویشاوند میشود. با این وجود آنالیز RFLP از نظر هزینه و وقت مقرون به صرفه نبوده و نیاز به مقدار نسبتا زیادی دی. اِن. اِ دارد. این محدودیتها بهوسیله معرفی نشانگرهای مبتنی بر پی. سی. آر مانند RAPD، ریزماهوارهها و AFLP رفع شده است. هر چند که هیچکدام از این تکنیکهای جایگزین بدون عیب نیستند. به عنوان مثال نشانگر RAPDبرای تهیه نقشههای پیوستگی ژنتیکی در گونههای گیاهی استفاده میشود، اما موارد استفاده این تکنولوژی به علت غیراختصاصی بودن آنها تنها به پروژههای نقشهیابی وسیع محدود میشود. از طرف دیگر ریزماهوارهها، نشانگرهای همبارزی هستند که سطوح بالاتری از تنوع آللی را نسبت به RAPD و RFLP شناسایی میکنند. ریزماهوارهها برای ساختن نقشههای متراکم ژنوم پستانداران مانند انسان و موش مورد استفاده قرار گرفتهاند. ریزماهوارهها میتوانند سطوح بالاتری از تنوع آللی را در گیاهان شناسایی کنند اما به پرایمرهای اختصاصی آلل نیاز دارند. اخیرا تکنیک توسعه یافته AFLP مورد استفاده قرار میگیرد که ظرفیت آزمایش تعداد بیشتری از لوکوسها را برای شناسایی پلیمورفیسم نسبت به RAPD و ریزماهوارهها دارد. این مزیت حتی در مورد مقایسه داخل گونهای جایی که پلیمورفیسم خیلی کمتر است نیز صدق میکند. به علاوه AFLP این مزیت را دارد که نیازی به اطلاعات توالی اولیه ندارد. روش جدیدتری از نشانگرهای (مارکرهای) مولکولی پلیمورفیسم ناشی از نوکلئوتیدهای منفرد (SNP) است که عمومیترین شکل پلیمورفیسم دی. اِن. اِ محسوب میشود که میتوان در یک ژنوم پیدا کرد. گمان میرود که یک SNP بهطور متوسط در فواصل 1000-300 باز وجود داشته باشد. عبارت مترادف دیگری که میتوان به جای مفهوم SNP به کار برد کلمه نشانگر دو آللی است که به این صورت تعریف میشود: دو آللی که ممکن است در یک موقعیت نوکلئوتیدی مشخص در یک سلول دیپلوئید با هم متفاوت باشند. به SNPها میتوان به دید نشانگرهایی نگاه کرد که احتمالاً در نسل آینده میتوانند باعث تکمیل و یا حتی جایگزین نشانگرهای موجود شوند که اکنون در آزمایشگاهها به طور معمول استفاده میشوند. یکی از علل جذابیت SNPها امکان شناسایی آنها با استفاده از سیستمهای غیر مبتنی بر ژن است. موفقیت بالای اینها همراه با سیستمهای اتوماسیون که در حال توسعه و پیشرفت هستند امکان استفاده از SNP را در سیستمهای مختلف فراهم میسازد. اگرچه در مجموع دادههای محدودی از SNP در گیاهان و جانوران وجود دارد ولی اخیراً مطالعات زیادی در این زمینه خصوصا در گیاه آرابیدوپسیس27 انجام شده است (گلهداری و همکاران، 1385).

2-13-4-1 انواع نشانگرهای دی. اِن. اِ
2-13-4-1-1 نشانگرهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز
تفاوت طول قطعات هضم شده محصولات پی. سی. آر28
تفاوت طول قطعات قابل تکثیر29
تفاوت فرم فضایی رشتههای منفرد30
تکثیر تصادفی دی. اِن. اِ پلیمورف31
ریزماهوارهها32
انگشتنگاری با دی. اِن. اِ تکثیر شده33

پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی34
تفاوت طول قطعات حاصل از تکثیر35
موقعیت توالی نشاندار36
ردیفهای بیان شده نشاندار37

2-13-4-1-2 نشانگرهای غیر مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم دی. اِن. اِ توسط آنزیم محدودگر38
پویش ژنومی نشانههای هضم39
ماهوارکها40
تعداد متغیرهای تکرارهای متوالی41 (فرهادی، 1392).

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد درموردهنجارهای اجتماعی

جدول 3-2 مقایسه کلی ویژگی انواع نشانگرها
SNP
AFLP
Microsatellite
RADP
RFLP
Minisatellite
ویژگی
عالی
عالی
عالی
عالی
عالی
متوسط
پراکندگی
ضعیف
ضعیف
عالی
متوسط
ضعیف
عالی
چند شکلی
بله
خیر
بله
خیر
بله
بله
هم بارزی
قابل قبول
قابل قبول
سریع
قابل قبول
قابل قبول
سریع
میزان جهش
عالی
متوسط
متوسط
متوسط
متوسط
خیلی کم
سرتاسری بودن
عالی
متوسط
عالی
ضعیف
عالی
ضعیف
توانایی موضعی
خیلی زیاد
خوب
خوب
کم
خوب
ضعیف
تکرار پذیری
(قره ویسی، 1389)
2-14 تکنیکRFLP PCR-
در این روش دی. اِن. اِ استخراج شده به وسیله آنزیم محدودکننده که عمدتاً توالی 4 تا 6 تایی را به طور اختصاصی بر روی ژنوم شناسایی کرده و سپس در جایگاه ویژهای، درون توالی شناسایی ژنوم را میشکند، برش داده میشود. قطعات حاصل از فعالیت آنزیمی توسط الکتروفورز روی ژل (آگارز یا اکریل آمید) جدا شده و بعد از رنگ آمیزی قطعاتی که دارای طول و وزن مشابهای هستند به صورت یک باند ظاهر میشوند این قطعات را “چند شکلی موجود بین طول باندها” مینامند. در ژنوم بزرگی مانند ائوکاریوتها باید از تکنیک دو رگگیری با کاوشگرهای42 دی. اِن. اِ خالص مانند سی. دی. اِن. اِ43 یا گنجینههای ژنومی برای شناسایی تفاوت طول قطعات حاصل از هضم دی. اِن. اِ توسط آنزیمهای محدودگر استفاده شود (نیکلاس، 1996).

از محاسن RFLP میتوان به:

بالابودن تکرار پذیری و دقت و قابلیت اعتماد این نشانگر
بالا بودن فراوانی آن
تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد درصد ژنتیکی است
همبارز میباشد
RFLP دارای معایبی همچون:
هزینه اولیه بالا
نیاز به مقدار نسبتا زیاد دی. اِن. اِ
در گونههای بسیار نزدیک این نشانگرها آلل مشابهای را نشان میدهند (گله داری، 1385).

2-15 آنزیمهای برشی
آنزیمهای برشی آنزیمهایی هستند که ردیف خاصی از دی. اِن. اِ را شناسایی میکنند و آنها را در یک نقطه برش میدهند. ردیفهای مورد شناسایی آنزیمهای محدودگر ممکن است 4 تا 8 نوکلئوتید طول داشته باشند، بیشتر این ردیفها پالیندروم44 هستند.

این آنزیمها را گاهی آنزیمهای برشی یا محدودکننده نیز مینامند (گلهداری و همکاران، 1385). منشاء اکثر این آنزیمهای برشی باکتریها میباشند و تا کنون حدود 200 نوع آنزیم محدود کننده جداسازی شده و توالیهای مورد شناسایی آنها نیز تعیین شده است. به طور کلی دو نوع برش به وسیله آنزیمهای اندونوکلئازی محدود کننده ایجاد شده و منجر به تولید دو سری مختلف از قطعهی دی. اِن. اِ میشود.
انتهای چسبناک: این برشها به وسیله آنزیمها ایجاد میشوند که پس از برش با این آنزیمها قطعاتی حاصل میشوند که در انتها تک رشتهای هستند و قادرند که بار دیگر به وسیله پیوندهای هیدروژنی به هم متصل شوند.
انتهای صاف: این برشها به وسیلهی آنزیمهایی ایجاد میشوند که رشته دی. اِن. اِ را به طور عمودی برش میدهند و در نتیجه قطعاتی با انتهای صاف به وجود میآورند که قادر به اتصال مجدد به یکدیگر نمیباشند (امتیازی و کریمی، 1386).

2-15-1 انواع آنزیمهای محدودکننده
آنزیمهای محدودکننده نوع I: این آنزیمها به ATPو SAM (آدنوزین مونو فسفات) به عنوان کوفاکتور واکنش نیاز دارند.
آنزیمهای محدودکننده نوع II: آنزیمهای این دسته به Mg به عنوان کوفاکتور نیاز دارند.
آنزیمهای محدودکننده نوع III: این گروه از آنزیمها هر دو فعالیت محدود کنندگی و تعدیلکنندگی توسط یک کمپلکس آنزیمی که شامل زیر واحدهای مختلط است انجام میدهند و به ATP و SAM نیاز ندارند (مهدوی و همکاران، 1386).

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد درموردالسلام-

2-16 چند شکلی45
وجود تفاوتهای قابل رؤیت که از ژنهایی با فراوانی بینابینی ناشی میشوند پلیمورفیسم یا چندشکلی مینامند، این اصطلاح همچنین در مورد مکانهای ژنی دارای چند آلل نیز بهکار میرود (فالکونر، 1392). جایگاهی را پلیمورف میگویند که برای یک ژن، دو یا چند آلل در آن وجود داشته باشد و همچنین فراوانی آلل کمیاب حداقل 1 درصد و فراوانی آلل فراوانتر حداکثر 99 درصد باشد (صبور علمی غروری، 1384). تنوع در صفات ظاهری، چند شکلی کروموزومی، چند شکلی پروتئینها و چندشکلی و چندشکلی دی. اِن. اِ اشکال مختلف بروز چندشکلی میباشند. چند شکلیهایی که در سطح دی. اِن. اِ وجود دارند، ممکن است در سطح توالیهای کد کننده و یا در توالیهای غیر کد کننده وجود داشته باشند. چند شکلیهای دی. اِن. اِ که در داخل و اطراف توالیهای ساختاری و یا تنظیم کننده یک ژن با اثرات فیزیولوژیک مشخص اتفاق میافتد (مثلاً ژنهای هورمونها و پروتئینهای شیر)، ممکن است به طور مستقیم بر بیان ژن اثر گذار باشند و بدین وسیله در تغییرات فنوتیپی بین افراد از لحاظ صفات تولیدی مشارکت داشته باشند. این نوع چندشکلیها با صفات تولیدی به طور نزدیکی مرتبط میباشند و میتوانند به عنوان نشانگر انتخاب بهکار برده شوند. مطالعات مختلف نشان داده است که تعدادی از جهشهای نقطهای در ژنهای ساختاری که دارای الگوی وراثت مندلی هستند، با صفات کمی دارای اهمیت اقتصادی مرتبط میباشند، به عنوان مثال چند شکلی پروتئینهای شیر با تفاوتهای موجود در ترکیب و خصوصیات فرآوری شیر مرتبط میباشد. تغییرات موجود در توالیهای غیر کد کننده (مثلاً در مناطق بین ژنی) به طور غیر مستقیم به عنوان نشانگر جهت تجزیه و تحلیل پیوستگی به کاربرده میشوند (مکپیاک46، 2001). امروزه با به کارگیری تکنیکهای مولکولی و استفاده از نشانگرهای دی. اِن. اِ امکان شناسایی ساختار اصلی سیستمهای ژنی و تنوع موجود در جوامع برای نواحی ویژهای در سطح ژنوم و انتخاب بر اساس نشانگرهای مولکولی فراهم آمده است (هانوتی47 و همکاران، 2005). جمعیتهای چند شکل انعکاس دهنده یک خزانه ژنی مطلوب میباشند. یک جایگاه زمانی چند شکل خواهد بود که اولاً برای یک ژن دو یا چند آلل وجود داشته باشد و ثانیاً از آلل نادر و کمیاب حداقل 01/0 درصد و از آلل فراوانتر 99/0 درصد در بین اعضای جمعیت وجود داشته باشد (ولیزاده و مقدم، 1377).

2-17 تنوع ژنتیکی48
تنوع ژنتیکی شامل تنوع دروننژادی و بیننژادی میباشد (کانتانن49 و همکاران، 2000). اصلاحگران از تنوع ژنتیکی برای رسیدن به حیوانات اهلی منطبق بر احتیاجشان بهرهگیری مینمایند. فقدان تنوع، قدرت انتخاب موجود برای رفع نیازهای غیر قابل پیش بینی آتی را محدود میسازد. تنوع دروننژادی پیوسته با تنوع جدید ناشی از جهش مواجه است ولی تنوع ژنتیکی بیننژادی را نمیتوان به راحتی بازسازی نمود. هر نژاد یا سویه حاصل فرآیندهای جهش، رانش ژنتیکی، تکامل و سازگاری مجزایی است که طی قرون متمادی حاصل گردیده است (هدریک50، 1999). احتمالاً متجاوز از 4500 نژاد و سویه حیوان اهلی در جهان وجود دارند که ذخایر ژنتیک حیوانی جهان را تشکیل میدهند که بیش از 30 درصد آنها در معرض خطر انقراض بوده و تعداد بسیار بیشتری نیز به واسطه بهرهبرداری نادرست تهدید میگردند (کوشوا51 و همکاران، 1996). بنابراین با حفظ نمونههایی از تم
امی نژادهای یک گونه که دارای بیشترین تفاوت ژنتیکی میباشند، میتوان حداکثر تنوع ژنتیکی را حفظ نمود (گیووامباتیستا52 و همکاران، 2001). این نمونهها نژادهایی را شامل میگردند که دارای آللها یا ترکیبات آللی منحصر به فرد میباشند. شرح کامل تفاوت ژنتیکی بین هر دو نژاد امکانپذیر نیست ولی معیارهای فاصله ژنتیکی بهترین شرح در دسترس برای بیان تفاوت ژنتیکی آنها میباشند (بارکر53، 1994). هتروزیگوتها طیف وسیعی از ژنوتیپها را به وجود میآورند. همچنین موجودات هتروزیگوس از نظر صفات اقتصادی مانند رشد، باروری و مقاومت به بیماریها اهمیت زیادی دارند. هتروزیگوسیتی در یک جمعیت به دو شکل هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده بیان میگردد (گای54 و همکاران، 2005). بر اساس قانون هاردی- وینبرگ در یک جمعیت که در آن آمیزشها به صورت تصادفی انجام میپذیرد، در صورت عدم وجود مهاجرت، جهش و انتخاب، فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی از نسلی به نسل دیگر ثابت باقی میماند. به علاوه، بین فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی رابطهی سادهای وجود دارد. جمعیتی که فراوانی ژنی و ژنوتیپی ثابتی داشته باشد، جمعیت در حال تعادل هاردی- وینبرگ نامیده میشود (فالکونر، 1392). به منظور بررسی تعادل هاردی- وینبرگ در یک جمعیت میتوان از آزمون کای مربع استفاده نمود. یکی از محدودیتهای این روش این است که نمیتوان از آن در مواردی که فراوانی مورد انتظار در فنوتیپها کمتر از 5 است، استفاده نمود. از آنجایی که فرمول کای مربع از یک توزیع پیوسته (توزیع نرمال) مشتق شده است و در بسیاری از مسائل ردههای فنوتیپی مجزا مورد بحث قرار میگیرند، اصلاحی در محاسبات کای مربع صورت گرفته است تا این عدم پیوستگی را تصحیح نماید. اصلاح │oi- ei│ یک قدر مطلق (مثبت) است (استانسفیلد، 1387):
فرمول (2-1) (∑_(i=1)^n▒〖[ │o_i- e_i│-0.5]2 〗)/e_i X2 = (اصلاح شده)
در رابطه بالا ∑_(i=1)^n▒ نشان دهنده جمع حالاتی است که در آن دستههای I از 1 تا n افزایش مییابند، همچنین oi و ei به ترتیب نشان دهنده اعداد مشاهده شده و اعداد مورد انتظار در آن دسته میباشند. فراوانی یک ژنوتیپ معین، نسبت یا درصد افراد آن ژنوتیپ در میان کل افراد است. در یک جایگاه ژنی با دو آلل A و a، در صورت در دست بودن فراوانیهای ژنوتیپی افراد، فراوانیهای ژنی آن مکان را میتوان به صورت زیر به دست آورد:
(فرمول 2-2) ((2NAA+ Naa))/2N F(A)= p=
(فرمول 2-3) ((2Naa + Naa))/2N F(a)= q =
در این رابطه p و q به ترتیب فراوانی آللهای A و a میباشند و N نشان دهنده تعداد افراد موجود از هر یک از ژنوتیپها در جمعیت میباشد. در این حالت بر اساس قانون هاردی- وینبرگ فراوانی ژنوتیپهای AA، Aa و aa در نتاج به ترتیب برابر p2، 2pq و q2 خواهد بود و مجموع فراوانیها برابر با یک میباشد:
(فرمول 2-4) 1 = q2 + 2pq + p2
با توجه به توضیحات بالا، هتروزیگوسیتی مورد انتظار را میتوان با استفاده از فرمول زیر محاسبه نمود:
(فرمول 2-5) 2pq = He ن
همچنین هتروزیگوسیتی مشاهده شده در یک جایگاه ژنی را میتوان به کمک فرمول زیر بدست آورد:
(فرمول 2-6)

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد رایگان درموردجنگ جهانی دوم

دیدگاهتان را بنویسید